SciAdv∣孙博沈彬合作揭示Cas9复合物结合位点及关键分子机制

　　原标题：Sci Adv ∣ 孙博/沈彬合作揭示Cas9复合物结合位点及关键分子机制

　　CRISPR-Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的免疫防御系统，用以对抗入侵的病毒及外源核酸【1】。目前，II类CRISPR-Cas系统中来源于酿脓链球菌的Streptococcus pyogenes Cas9（spCas9）研究最为广泛。在该系统中，Cas9蛋白作为核酸内切酶识别前间区序列临近基序（protospacer adjacent motif, PAM）【2，3】，在指导RNA(guide RNA, gRNA）的指引下匹配目标DNA序列后激活蛋白的酶切活性。正是由于这种精准的靶向功能，CRISPR/Cas9系统已被广泛应用于各物种的基因编辑、基因的激活和抑制、定位成像、病毒检测、细胞谱系追踪等诸多领域【4】。然而， Cas9蛋白天然存在脱靶效应，虽然多个研究组对这一系统进行了各种优化，但是还是存在诸多不可预知的风险，特别是应用到临床上，其安全性更值得慎重考虑。因此，有必要对CRISPR/Cas9从各个层面进行深入研究，以提高这一体统的精确性和安全性。

　　此篇报道中，研究人员利用单分子光镊DNA解链（unzipping）技术，以近单碱基的空间分辨率检测了来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的spCas9/sgRNA与DNA之间相互作用的位点及强度（图1）。出人意料的是，除了在spCas9的20 碱基对识别区内近PAM的位置检测到一个可预知的强作用位点-前PAM互作位点（pre-PAM interaction）外，作者在PAM下游检测到一个全新的相互作用位点-后PAM互作位点（post-PAM interaction）。虽然该位点弱于pre-PAM interaction，但是将其破坏后，会导致整个三元复合体立刻崩塌。在sgRNA和目标DNA错配的情况下，post-PAM interaction仍然存在，说明这个结合位点可能先于R-loop的形成。为了进一步验证post-PAM interaction的重要性，作者通过逐步截短PAM下游的DNA序列，发现 Cas9的结合和切割能力均随着下游序列的变短而逐渐下降。此外，如果提前占据目标DNA上post-PAM interaction的位置，亦会影响Cas9的结合和切割。这也一定程度上解释了作者之前的发现【5，6】：在使用Cas9 nickase/dual sgRNAs对DNA进行切割时，PAM尾对尾（tail to tail或PAM-out）的切割效率要远高于PAM头对头（head to head，或PAM-in）的方式。这是因为PAM头对头时，占据了彼此的post-PAM interaction的位点，影响了Cas9 nickase和目标DNA的结合。

　　post-PAM interaction有什么生物学意义呢？之前研究报道，Cas9切割目标DNA之后，仍然会长时间结合在目标区域【7-9】，从而会影响DNA的修复。作者进一步利用DNA修复型解旋酶BLM研究其能否有效解离与目标DNA结合的Cas9蛋白。实验发现BLM更容易从PAM下游方向将Cas9与DNA解离，这也和前面发现的post-PAM interaction弱于pre-PAM interaction相一致。

　　综上，作者结合单分子和生化实验，证明post-PAM interaction这一全新作用位点对Cas9/sgRNA与目标DNA的结合、切割、解离均有着关键的调节作用。该工作为进一步提高CRISPR-Cas9系统的精确性和安全性提供了一个全新的视角。

　　孙博 博士，上海科技大学生命科学与技术学院助理教授、研究员。长期从事利用单分子技术（光镊、磁镊、FRET等）解析核酸互作蛋白的分子机制的相关研究，尤其聚焦于马达蛋白（例如：解旋酶，聚合酶、核酸酶等）的酶反应动力学过程及其相应的生物学功能。先后以第一或通讯作者身份在Nature、Nature Communications、Science Advances、EMBO Journal等国际主流期刊发表多篇研究论文。

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