目的 探讨术中应用免疫胶体金法（ICGT）快速测定组织内甲状旁腺素（PTH）水平（以下简称PTH- ICGT法）的临床应用价值。方法 选择2016年1～5月华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科79例甲状腺腺叶切除手术病人，术中行PTH-ICGT法快速测定并比较分析甲状旁腺附近颈部不同组织内PTH水平；选择2016年6～12月同单位106例甲状腺全切除手术病人，随机分为PTH-ICGT组（53例）和常规肉眼组（53例），比较分析两组甲状旁腺发现率和甲状旁腺功能减退发生率。结果 79例接受甲状腺腺叶切除术病人中，PTH-ICGT法检测结果显示，甲状旁腺组织PTH浓度为（955.3±16.1）ng/L；骨骼肌组织［（14.5±1.5）ng/L］、甲状腺组织［（15.0±1.3）ng/L］、脂肪组织［（15.3 ±1.2）ng/L］、淋巴结组织［（14.0±1.2）ng/L］内PTH含量极低，甲状旁腺组织中PTH表达水平分别与骨骼肌、甲状腺、脂肪、淋巴结组织内PTH表达水平相比差异均有统计学意义（t值分别为23.62、33.42、39.34、30.77，P均0.0001）；PTH-ICGT法检测距离甲状旁腺周围1 mm、2 mm、3 mm、5 mm组织中PTH浓度分别为（14.6±1.5）ng/L、（16.7±1.6）ng/L、（15.1±1.4）ng/L和（13.0±1.1）ng/L，甲状旁腺组织中所测得PTH值与不同距离组织所测得PTH值差异有统计学意义（t值分别为23.62，30.68，33.42，31.50，P均0.0001）；采用常规肉眼法识别甲状旁腺组织总符合率为74.1%，PTH-ICGT法则为98.6%，两种方法比较差异有统计学意义（χ2=35.57，P0.0001）。106例接受甲状腺全切除手术病人中，常规肉眼组甲状旁腺发现率为92.4%，PTH-ICGT组为96.2%，两组甲状旁腺发现率比较差异无统计学意义（χ2=0.7067，P=0.40）。两组术后暂时性甲状旁腺功能减退发生率分别为11.3%和5.7%（χ2=1.093，P0.05）。两组术后永久性甲状旁腺功能减退的发生率分别为3.8%和0（Fisher确切概率法检验，P=0.495）。结论 PTH-ICGT法术中甲状旁腺的识别效率较高，可能会提高临床甲状旁腺发现率并降低手术相关甲状旁腺功能减退发生率，但仍需要大样本研究进一步验证。
基金项目：华中科技大学同济医学院研究型临床医师资助计划（No.5001540018）
作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科，武汉430030
甲状旁腺的保护是甲状腺手术的难点，术中鉴定甲状旁腺尤为关键。目前常用的甲状旁腺识别鉴定方法都存在一定的局限性和不足［1-2］。采用术中免疫胶体金法（immune colloidal gold technique，ICGT）快速测定组织内甲状旁腺素（PTH）水平（以下简称PTH- ICGT法），以提高术中甲状旁腺识别率，在国内外鲜见报道。笔者采用PTH-ICGT法可在术中快速有效的鉴定甲状旁腺，提高术中甲状旁腺识别率，降低手术相关甲状旁腺功能减退的发生率，取得了良好效果。现报告如下。
1.1 一般资料 选择2016年1～5月在华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科接受甲状腺单侧腺叶切除手术病人79例，其中男性33例，女性46例。年龄28~65（40.6±8.3）岁。甲状腺单侧腺叶切除手术指征为单侧单发或良性多发肿瘤，最大直径4 cm者。
选择2016年6～12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科接受甲状腺全切除手术病人106例，其中男性49例，女性57例。病人年龄22~68（45.6±17.3）岁。甲状腺全切除术手术指征为双侧多发良性病变、直径4 cm者，单侧或双侧甲状腺癌。其中良性17例，恶性89例。恶性病例常规清扫同侧或双侧中央区淋巴结。
所有手术均由同一组医生操作完成。相关手术及PTH-ICGT检测均经笔者医院伦理委员会批准（No.TJ-C20151231），病人及家属均知情同意。
1.2.1.2 PTH-ICGT法组织洗脱液取样方法 包括：（1） 组织块匀浆法。取1 mm3目标组织块，将组织切碎呈匀浆样，稀释于1 mL生理盐水中。将上述液体送检。（2）镊子夹取法。用眼科齿镊钳夹目标组织3次后，在1 mL生理盐水中盥洗；重复上述动作，共3次。将上述液体送检。（3）针吸法。用1 mL注射器，带负压穿刺抽吸目标组织3次，将上述针头在1 mL生理盐水中反复抽吸；重复上述动作，共3次。将上述液体送检。分别采用以上3种方法对同一部位目标组织取样，检测PTH，并送快速冰冻切片病理学检查进行对照。
1.2.1.3 取样组织 按1.2.1.2方法分别采集：（1）甲状腺附近颈部骨骼肌组织、甲状腺组织、脂肪组织、淋巴结组织及甲状旁腺组织等标本。（2）甲状旁腺及其周边不同距离组织标本（甲状腺组织或脂肪组织），距离分别为1 mm、2 mm、3 mm、5 mm。（3）肉眼疑似甲状旁腺组织。组织取样后行术中快速冰冻切片病理学检查证实，并进行组织洗脱液PTH测定，所测结果分别计入常规肉眼法和PTH-ICGT法识别组织效率的比较中。
1.2.2 PTH-ICGT法检测步骤 取上述不同取材方法组织洗脱液90 μL，滴加在PTH-ICGT试纸条加样区，孵育10 min；ICGT检测仪开机后，采用PTH常规检验模式，将加样后的试剂条放在检测区域读取PTH结果。由同一位医生加样和操作仪器进行PTH检测。ICGT检测仪所有测得PTH10.0 ng/L者均换算为10.0 ng/L；1000.0 ng/L者均换算为1000.0 ng/L。每次PTH-ICGT技术检测PTH约耗时12～15 min，包括取样、加样、孵育、测量、读值等步骤，其中孵育部分耗时10 min。
1.3 统计指标及分析方法 PTH-ICGT法与罗氏法比较采用线例接受甲状腺腺叶切除术病人甲状旁腺附近颈部不同组织内及甲状旁腺周边不同距离组织内PTH的浓度；检测 PTH-ICGT法3种不同取样方式在不同组织内的PTH浓度，并与病理学检查结果对照计算cut-off值，目标组织洗脱液PTH表达水平大于相应取材方式的cut-off值时，即可判定为甲状旁腺组织，比较3种取样方式灵敏度及特异度；分别比较PTH-ICGT法和常规肉眼法（肉眼识别±纳米碳负显影）与术中病理学检查总符合率之间的差异。采用随机数表法，将106例接受甲状腺全切除术病人随机分为常规肉眼组（53例）和PTH-ICGT组（53例）：常规肉眼组应用常规方法（肉眼识别±纳米碳负显影）识别甲状旁腺；手术即将结束时向手术医生揭盲，PTH-ICGT组病人加用PTH-ICGT技术识别甲状旁腺；分别于术后1 d、7 d、1个月、6个月常规检测两组血清PTH水平，比较两组甲状旁腺发现率和甲状旁腺功能减退发生率。数据分析用SPSS16.0软件进行，计量资料用均数±标准差表示；符合率用百分率（％）表示，一般资料采用描述性统计，相关性分析采用线性回归统计方法，组间比较采用t检验，配对四格表比较两个总体率用χ2检验或Fisher确切概率法检验。P0.05为差异有统计学意义。
2.1 PTH-ICGT法与罗氏法比较 前期研究中，收集130例静脉血液标本，分别采用罗氏法和PTH-ICGT法检测血清中PTH水平。结果如图1，线性回归分析结果为：Y= 1.482*X - 27.499，两者相关系数R2=0.7744（相关系数r=0.88）。与经典罗氏法检测PTH相比较，PTH-ICGT法可以有效检测样本中甲状旁腺素水平。
2.2 不同组织内PTH的表达和分布特点 以组织块匀浆法为取样方式行PTH-ICGT法检测。79例接受甲状腺腺叶切除术病人中，取甲状旁腺组织标本79块；非甲状旁腺组织包括骨骼肌标本13块，甲状腺组织标本26块，脂肪组织标本36块，淋巴组织标本22块；距离甲状旁腺1 mm处标本26块，2 mm处标本22块，3 mm处标本26块，5 mm处标本23块。检测结果显示，甲状旁腺组织存在高浓度PTH表达，为（955.3±16.1）ng/L。
2.2.1 甲状旁腺附近颈部不同组织内PTH的表达水平 PTH在骨骼肌组织［（14.5±1.5）ng/L］、甲状腺组织［（15.0±1.3）ng/L］、脂肪组织［（15.3 ±1.2）ng/L］、淋巴结组织内［（14.0±1.2）ng/L］含量极低。甲状旁腺组织中PTH表达水平分别与骨骼肌、甲状腺、脂肪、淋巴结组织内PTH表达水平相比差异均有统计学意义（t值依次为23.62、33.42、39.34、30.77，P均0.0001）。
2.3 不同取样方式对甲状旁腺识别的影响 对79例接受甲状腺腺叶切除术病人分别采用组织块匀浆法、镊子夹取法、针吸法取样行PTH-ICGT法测得甲状旁腺组织洗脱液PTH浓度分别为（955.3±16.1）ng/L、（593.9±39.2）ng/L和（224.0±54.6）ng/L；非甲状旁腺组织洗脱液PTH浓度分别为（15.3±0.9） ng/L、（20.0±1.3） ng/L和（14.1±0.9） ng/L。与病理学检查结果对照，组织块匀浆法、镊子夹取法、针吸法3种不同取样方法所对应的cut-off值（ng/L）分别为136.3、60.6和23.2。针吸法的灵敏度低于组织块匀浆法和镊子夹取法（χ2=8.333，P0.05）（表1）。
2.4 PTH-ICGT法（镊子夹取法取样）与常规肉眼法识别甲状旁腺效率比较 同时采用常规肉眼法、PTH-ICGT法和术中病理学检测79例接受甲状腺腺叶切除术病人139块目标组织结构，结果显示术中病理学证实78块为甲状旁腺组织，61块为非甲状旁腺组织。常规肉眼法识别结果与术中病理学检测结果相比，总符合率为74.1%（103/139），其中，阳性符合率为78.2%（61/78），阴性符合率为68.8%（42/61），两者总符合率差异有统计学意义（χ2=41.58，P0.0001）。PTH-ICGT法识别结果与病理学检测结果之间进行比较，PTH-ICGT法识别组织总符合率为98.6%（137/139），其中阳性符合率为97.4%（76/78），阴性符合率为100%（61/61），两者差异无统计学意义（χ2=2.026，P0.05）。常规肉眼法与PTH-ICGT法识别结果之间在总符合率方面进行卡方检验结果差异有统计学意义（χ2=35.57，P0.0001）。
2.5 PTH-ICGT法与常规肉眼法识别甲状旁腺临床应用效果比较 106例接受甲状腺全切除手术病人中，常规肉眼组（n=53）共发现甲状旁腺167枚，术中甲状旁腺发现率（术中至少发现1枚甲状旁腺）为92.4%； PTH-ICGT组（n=53）共发现甲状旁腺189枚，术中甲状旁腺发现率为96.2%；两组甲状旁腺发现率比较差异无统计学意义（χ2=0.7067，P=0.40）。术后中位随访时间7.6个月（3～12个月）。常规肉眼组和PTH-ICGT组术后暂时性甲状旁腺功能减退发生率分别为11.3%和5.7%（χ2=1.093，P0.05），术后永久性甲状旁腺功能减退的发生率分别为3.8%和0（Fisher确切概率法检验，P=0.495，P0.05）。
一般认为，PTH仅在甲状旁腺组织内特性表达，但其浓度分布方式，少见报道。本研究利用PTH-ICGT技术，检测甲状旁腺组织附近甲状腺组织、肌肉组织、淋巴结、脂肪组织中的PTH含量均极低，进一步证明PTH表达有明显的组织特异性。同时检测还发现，甲状旁腺周围PTH水平呈断崖式分布，而非坡度式改变，即甲状旁腺组织内PTH含量极高，周边组织内PTH含量极低。目标组织存在PTH高表达时，即可判定为甲状旁腺组织。这种PTH的组织特异性和断崖式分布特性，为临床上检测识别甲状旁腺提供了理论基础。
为了临床应用方便，本研究还比较了组织匀浆取样法、镊子夹取取样法、针吸法取样法3种方法对甲状旁腺识别效能的影响。结果发现，不同的取样方法测得PTH水平结果不同，判定甲状旁腺的cut-off值也不尽相同。针吸法取样法与前两种方法相比，灵敏度较差；而组织匀浆取样法和镊子夹取取样法结果可靠，且在特异度和灵敏度方面差异无统计学意义。考虑到临床使用方便和组织损伤最小化，笔者推荐临床使用镊子夹取取样法。
经验丰富的专业医师可以根据甲状旁腺的解剖部位、外观（颜色、包膜、质地、色泽、厚度、血供等）及对缺血的耐受性等来综合判断。但甲状旁腺经常不易与周边的脂肪颗粒、淋巴结、异位甲状腺及异位胸腺相区别，特别是在二次手术或手术视野血染时，及甲状腺癌浸润及气管旁淋巴结转移肿大时。生理盐水沉浮实验常不太可靠，且无法区别淋巴结。纳米碳甲状旁腺负显影辨认保护技术有助于术中辨认及保护甲状旁腺［1］；但纳米碳技术仍不能有效区别甲状旁腺和脂肪组织。
文献［3-4］研究显示，利用细针穿刺可疑组织，检测细针穿刺洗脱液内PTH浓度，可以有效区分甲状旁腺组织和非甲状旁腺组织。其检测方法为罗氏PTH检测试剂盒（电化学发光免疫分析）［4-7］，PTH检测过程约20～40 min；且需专门设备及人员操作。
术中冰冻病理学检查可有效区分甲状旁腺及上述非甲状旁腺组织，惟耗时较长、技术复杂且较为昂贵。
本研究中，采用ICGT技术制备了用于PTH检测的试纸。样品中的待检物（PTH）在反应区与PTH抗体的胶体金偶合物结合形成免疫复合物，并在测试区形成检测线；反应完成后，通过检测仪对检测线和质控线进行扫描分析，从而定量检测血液中的PTH含量。在血清PTH值检测方面，本实验证实该方法与罗氏法PTH检测试剂盒有相似检测效能，相关系数为0.88。实际操作中，PTH-ICGT技术操作简单快捷，仅需一人床边操作；结果判读迅速直观，耗时仅需12～15 min。
本研究发现，与术中主观判断相比， PTH-ICGT法明显增加术中甲状旁腺的识别效率。与术中快速冰冻切片病理学检查和经典罗氏PTH测定法相比，PTH-ICGT技术检测时间明显缩短，实用性较强。但本研究中，两组病人甲状旁腺发现率，以及手术后暂时性和永久性甲状旁腺功能减退发生率差异无统计学意义，这可能与样本量较小，随访时间较短有关。
研究显示，PTH-ICGT技术应用于术中快速鉴定和识别甲状旁腺，具有较高临床价值。其操作简单快捷；结果判读直观，准确率高；且金标试剂稳定，可长期保存［8-10］。取样过程对甲状旁腺组织损伤轻。整个检测技术，价格低廉，可多次、多点测量，经济高效。
结合本文及文献结果，笔者推荐，目前PTH-ICGT技术可应用于以下各方面：（1）甲状旁腺组织种植前，进一步确认。（2）特别适用于经验不够丰富中青年医师开展甲状腺手术。（3）基层医院（特别是不具备PTH检测、术中冰冻病理学检测等条件）开展甲状腺手术。（4）二次手术、复杂甲状腺癌手术、出血污染创面，甲状旁腺不易识别时等情况。相信随着此项技术的推广应用，相关大样本研究将进一步验证其效果，从而助力于推进各级医院开展甲状腺手术，降低甲状旁腺相关并发症，不断提高甲状腺手术质量。
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