非编码RNA之piRNA最新研究进展

　　2017年10月31日/生物谷BIOON/---Piwi互作RNA(piRNA)是近年来新发现的一类小RNA，主要在生殖细胞系中表达，对于维持生殖系DNA完整、转座子、翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用。过去的研究表明，生殖细胞性表达的PIWI家族蛋白是piRNA作用途径的中心，为piRNA生物生成及功能所必需。小鼠PIWI家族包括MILI、MIWI和MIWI2三个，性地在中表达，对小鼠精子发生至关重要。

　　piRNA发现于2006年，在动物生殖细胞系中它与特定蛋白一同转座子。这种蛋白- RNA的组合形成了一个防御系统，科学家们将其比作基因组的免疫系统。与免疫系统相似，piRNA系统能够区分敌我，启动应答，并且去适应新出现的入侵者。这些基因组卫士们还能够记住曾经入侵的转座子。在进化过程中piRNA的复杂性曾经历了爆炸式增长，科学家们认为人体内的piRNA总共可能有数百万种。目前的研究表明，piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来调控基因沉默途径。piRNA在沉默基因过程、维持生殖系和干细胞功能以及调节翻译和mRNA的稳定性等功能中发挥着重要的作用。1.Nature：常规！细胞产生piRNA新机制doi:10.1038/nature23482

　　维持动物基因组完整性的一种重要的通是piRNA通。piRNA通在生殖细胞中是有活性的，而且利用被称作piRNA的小片段RNA互补性地结合到基因的本上，因而利用与piRNA结合的Argonaut蛋白启动沉默。奥地利科学院生物技术研究所（IMBA）的Julius Brennecke实验室一直在果蝇中利用前沿的下一代测序技术积极地探究这些基于RNA的防御机制。piRNA的来源位于基因组中含有DNA序列的沉默区域。这种组装便产生一种进化中的“先有鸡还是先有蛋”困境：piRNA如何能够由它们沉默的基因组区域产生？在一项新的研究中，Brennecke实验室不仅解决了这个谜团，而且也描述了一种全新的基因表达机制。相关研究结果于2017年8月23日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“A heterochromatin-dependent transcription machinery drives piRNA expression”。这种新发现的通围绕着一种被称作Moonshiner的蛋白。Moonshiner蛋白是一种基础因子的同源蛋白，与Rhino蛋白相互作用。Rhino是一种结合到基因的异染色质上的蛋白。Rhino蛋白将Moonshiner蛋白招募到这种异染色质区域，随后Moonshiner蛋白启动催化的RNA聚合酶II-前起始复合物（RNA polymerase II pre-initiation complex）组装。因此，在原本沉默的基因组区域中的基因表达是通过一种嵌入在组蛋白标记而不是在DNA序列中的不同代码进行激活的。这些发现表明piRNA了经典的基因激活规则，涉及将标准的基因激活与基因沉默组合在一起。2.Cell：重大突破！鉴定出剪切piRNA前体的核酸酶Trimmerdoi:10.1016/j.cell.2016.01.008生殖细胞中有一类小RNA其基因组发生不需要的基因重写。在一项新的研究中，来自日本东京大学的一个研究小组鉴定出一种被称作Trimmer的酶，该酶参与这类小RNA的产生。相关研究结果发表在2016年2月25日那期Cell期刊上，论文标题为“Identification and Functional Analysis of the Pre-piRNA 3Trimmer in Silkworms”。“跳跃基因”或者说转座子是一小段DNA序列，能够在基因组中移动。它们能够宿主基因，而且也参与癌症和其他疾病的产生。因此，有机体需要持续控制它们，特别是在产生精子和卵子的生殖细胞中以便确保后代的基因组完整性。在生殖细胞中，这是通过一类被称作piRNA（PIWI-interacting RNA，与PIWI蛋白相互作用的RNA）的小RNA来实现的。这些piRNA通常长24～30个核苷酸，能够跳跃基因表达。piRNA被认为是通过剪切它们的序列更长的前体（pre-piRNA）的3末端而形成的。然而，负责这种剪切过程的酶仍然未知。在这项研究中，东京大学与细胞生物科学研究所的Natsuko Izumi助理研究员和Yukihide Tomari教授及其同事们成功地在桑蚕卵巢细胞中将一种之前未曾描述过的核糖核酸酶确定为剪切蛋白Trimmer。他们的数据Trimmer不能单独发挥作用：它需要Papi---一种PIWI相关蛋白---的配合来剪切pre-piRNA的3末端。再者，他们剪切这些pre-piRNA的3末端在piRNA的功能中发挥着重要作用，而且可能是在线粒体的表面上发生的。3.Cell Res：刘默芳等发现小鼠粗线期piRNA在精子发育中的重要功能doi:10.1038/cr.2014.41

　　国际学术期刊Cell Research 于5月2日在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘默芳研究组关于小鼠粗线期piRNA指导精子形成后期mRNA大规模清除的最新研究。不同于卵子含有大量母源mRNA和蛋白质支持早期胚胎发育，成熟精子中仅残留微量的mRNA，但目前还不清楚精子细胞中大量的mRNA是如何在形成精子前被大规模降解清除的。piRNA 是新近在动物生殖系细胞中发现的一类与PIWI家族蛋白相互作用的小非编码RNA，在哺乳动物的精子发生过程先后出现两次表达高峰，分别被称为前粗线期piRNA与粗线期piRNA。目前对在早期生精细胞中表达的前粗线期piRNA的作用已有所了解，而在减数前后大量表达的粗线期piRNA的功能还鲜为人知；粗线期piRNA的功能机制是领域当前普遍关注的前沿热点。刘默芳研究组苟兰涛博士、研究生戴鹏和中山大学杨建华博士等共同发现，在小鼠延长形精子细胞中，粗线期piRNA与其结合蛋白MIWI、脱腺苷酸酶CAF1组成pi-RISC复合物，通过碱基不完全配对方式识别靶mRNA 3非翻译区（3￠UTR）的序列元件、靶mRNA脱腺苷酸及降解；依赖于piRNA百万级数量的不同序列，pi-RISC介导了精子细胞发育后期数千不同mRNA的降解。这一研究工作不仅提供了精子形成后期mRNA大规模降解的机制，同时了粗线期piRNA在精子发育中的重要功能，并证明piRNA除了沉默转座子外，还参与调控编码基因。4.Dev. Cell：解析piRNA作用通doi:10.1016/j.devcel.2012.12.006来自中科院上海生命科学研究院的研究人员近日在新研究中，piRNA在精子发生后期通过APC/C触发了MIWI泛素化及MIWI/piRNA机器清除。这一研究发现对于深入了解piRNA作用通在哺乳动物精子发生中的功能机制具有重要意义。相关论文发布在1月14日的《发育生物学》（Developmental Cell）上。在这篇文章中，研究人员小鼠PIWI (MIWI)是通过APC/C-26S蛋白酶体信号通进行降解，piRNAs通过促进MIWI与一种APC/C底物结合亚基的互作在这一过程中发挥了至关重要的作用。有趣的是，研究人员发现在晚期精细胞中piRNA触发的MIWI，转而导致了piRNA消除，这了一条在特定的发育阶段调节性清除MIWI/piRNA机器的前馈机制。重要的是，研究人员发现适当清除MIWI/piRNA是精子成熟的必要条件。这些结果表明piRNAs通过泛素-蛋白酶体信号通调控了MIWI/piRNA机器的清除，在雄性生殖细胞发育过程中适当的时序调控MIWI/piRNA具有非常重要的意义。5.Science：基因组卫士piRNA的故事doi:10.1126/science.339.6115.25与绝大多数动物一样，人类基因组不少都来自于一种的DNA链——转座子。这类遗传物质能够在染色体不同位点间跳跃，导致基因失活甚至引发癌症。在生殖细胞系中，转座子的跳跃还可能导致不孕。“对于绝大多数动物来说，无法控制转座子都会最终导致，”麻省大学医学院的生化遗传学家Phillip Zamore说。正因如此，一类特殊的RNA（piRNA）就成了动物基因组的大英雄。piRNA发现于2006年，在动物生殖细胞系中它与特定蛋白一同转座子。这种蛋白- RNA的组合形成了一个防御系统，科学家们将其比作基因组的免疫系统。与免疫系统相似，piRNA系统能够区分敌我，启动应答，并且去适应新出现的入侵者。这些基因组卫士们还能够记住曾经入侵的转座子。在进化过程中piRNA的复杂性曾经历了爆炸式增长，科学家们认为人体内的piRNA总共可能有数百万种。近年来，研究人员开始慢慢理解piRNA约束转座子的机制，但人们依然不了解细胞制造piRNA的过程，也不清楚这些RNA在生殖细胞系以外还有何功能。Zamore指出，在哺乳动物中piRNA沉默转座子只是其功能的一小部分，尽管这也是人们目前唯一了解的部分。2012年前后piRNA研究领域了令人兴奋的新时代，该领域的重要纷纷登上Science、Nature、Cell等顶尖。本期Science就对近来的piRNA研究进行了系统性总结和展望。6.Bioinformatics：动物所piRNA的高精度预测算法研究获得突破doi:10.1093/bioinformatics/btr016中国科学院动物研究所康乐研究组的张屹等最近发表的题为A k-mer scheme to predict piRNA and characterize locust piRNA 的最新研究论文，解决了高精度预测生物体中数量最大的一类非编码RNA---piRNA的难题，论文发表在生物信息学权威期刊《生物信息学》（Bioinformatics，IF=4.926）上。这篇文章中提出了一种基于k-mer串频率的Fisher判别式来预测piRNA的算法, 精度达90%以上，超过了哈佛大学B. Doron的61%的精度。利用该方法，他们成功地鉴定出飞蝗8万多条piRNA，预测飞蝗可能存在约13万条piRNA。进一步分析发现，这些piRNA在飞蝗群居型和散居型间存在巨大差异，这可能为解释飞蝗两型生殖力差异提供了重要的线索。这个不依赖基因组数据来鉴定非模式生物piRNA的新方法具有重要的理论意义和广泛的应用价值。目前，在线软件piRNApredictor (已被国外科研机构用于猪的piRNA研究中。7.Nature：新型小RNA-piRNA被发现 掀起新一轮小RNA热doi:10.1038/nature04917小RNA联合Argonaute蛋白作为一种序列性的来调节mRNA的稳定性、蛋白的合成、染色质的组构和基因组的结构。在动物中，Argonaute蛋白分为两种亚家族：与RNA相关和利用长度为21-22个核苷酸的RNA序列进行microRNA介导的基因调控相关的亚家族；而Piwi亚家族与生殖细胞性事件相关，例如保养生殖干细胞和减数。然而，Piwi蛋白的生物化学功能和它指导小RNA的机理并不为人所知。在文章中，我们展示了老鼠的Piwi蛋白——MIWI与一类之前未曾描述的在]中富含的29–30核苷酸的RNA相结合的结果。我们因此把这些与Piwi蛋白相作用的RNA称为piRNAs。piRNAs在基因组中显示出与众不同的定位类型，主要成群地分为长20–90kb的基因簇，其中的长片断的小RNA只能来源于单链。相似的piRNAs在人类和小鼠中均有发现，大部分基因簇出现在同一染色体的上。虽然piRNA的功能仍然需要研究阐明，但是生殖细胞中的piRNA富集现象和Miwi突变导致的男性不育表明piRNA在配子形成的过程中起作用。在各种不同的基因沉默过程中，小RNA与Argonaute蛋白结合来识别部分或者全部的序列互补的核酸靶标。Argonaute蛋白的一种亚家族——Piwi蛋白家族，为无脊椎动物的精子和干细胞的发育所必需。两种Piwi蛋白家族：MILI 和MIWI是小鼠精子形成所必需的。在文章中，我们描述了一类与小鼠雄性精子细胞的MILI蛋白结合的新型小RNA，这些小RNA在减数起始期积累。所确证的这些1,000多条独特小RNA序列均具有强的5尿嘧啶偏爱性，否则，就不能容易地将这些序列分类成一个家族。这些小RNA的遗传图谱显示了数量有限的基因簇，表明这些小RNA由较长的初级产物加工而成。这些小RNA的长度为26–31个核苷酸。明显与21–23个核苷酸的microRNAs和短siRNAs不同。因此我们称其为“Piwi相互作用RNA”或者piRNAs。直系同源（Orthologous）的人类染色体区域也能产生具有piRNAs特性的小RNA，但序列不相同。该类新型小RNA的为确定哺乳动物中精子形成过程中的Piwi蛋白的作用提供了起点。8.Science：发现新一类基因沉默的小RNA—piRNAdoi:10.1126/science.1130164编码性的小RNA调节着一些对细胞生长和发育必需的过程，包括mRNA降解，翻译，阶段基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)。在哺乳动物中寻找造成TGS的因子过程里，作者纯化出一个含有小RNA和Riwi(老鼠中的人类Piwi的同源物)。这些RNA，长度通常在29-30nt，被称为与Piwi相互作用作用的piRNA复合物的(piRC)制备物中含有rRecQ1，其中rRecQ1是脉孢菌(Neurospora) qde-3基因表达蛋白的同源物，该基因参与沉默途径作用。Piwi在苍蝇里就已与TGS在遗传上联系起来，也与纯化的piRNA复合物的具有切割活性的共分级分离(cofractionate)物联系。这些结果就与piRC中存在着一个基因沉默作用相一致。该研究已经发表在06年06月15日的《Science》的网络版Sciencexpress上。通过将制备的老鼠粗提物进行离子交换Q柱分离，分成流出物和洗脱物两部分，同时小RNA，构建cDNA文库后进行测序，发现流出物中的RNA主要是microRNA(miRNA)，洗脱物中的RNA(69%)主要是从那些平常被认为不能表达的基因组区域获得的，长度大多在25-31nt，而且Northern印迹分析也显示出一个性的特征。大多数的洗脱物中RNA5’端大多以尿苷开始(约84%)，但没有特征性序列或基序被检测到。而且，在洗脱物中RNA观察到一个明显的亚群体(subpopulation)长度在29-30nt，然而它们与洗脱物中的其他的RNA无论是在5’核苷，基因组上的位点，还是注释上都不能去区别开来。因此，所有洗脱出的RNA不能与已经注释的非编码性的RNA(miRNA, tRNA, rRNA, snRNA)配备，而一起被认为代表着新鉴定出的一类小RNA。随后又通过五步的实验程序纯化与这类小RNA作用的蛋白，质谱结果鉴定出老鼠中存在人类Piwi和RecQ1蛋白的同源物(分别称为Riwi和rRecQ1)。Western印迹结果也Riwi和rRecQ1与这些小RNA共纯化。因此，作者将这类小RNA命名为与Piwi相互作用的RNA(piRNA)，并将与老鼠Piwi同源物一起形成的复合物称为piRNA复合物。人类的RecQ1是一个ATP依赖性的DNA解旋酶，它的ATPase和DNA解旋活性在piRC中的rRecQ1蛋白也存在。Riwi含有催化性的氨基酸残基，这些残基在其他的Ago家族蛋白中被用来进行RNA指导的靶标RNA切割。通过使用与piRNA互补的底物，也能检测到切割活性，尤其是在含有Riwi和piRNA的组分中活性最高，然而，活性不强健，这可能是不同piRNA组成的总体中相关的piRNA所占比重较小(〈0.2%)的缘故。Piwi蛋白代表着Ago蛋白家族中的一个分支(subclade)，首次在在果蝇(Drosophila)中发现，起着调节生殖干细胞维持的作用。随后也发现哺乳动物的Piwi蛋白调节着生殖细胞的成熟。piwi基因突变的果蝇在小RNA依赖性的转基因和逆转座子沉默上存在缺陷，同时也了异染色质蛋白的。四膜虫(Tetrahymena) Piwi (TIWI)对siRNA调节的DNA降解是必需的。9.Science：线虫piRNAs的功能、靶点和进化doi:10.1126/science.1220952

　　2012年6月14日，Science在线报道了线虫piRNAs研究最新进展。Piwi-相互作用RNA（piRNAs）是维持生殖细胞系完整性和可育性所必须的一类小RNA，但其作用机制尚不明确。本研究，线虫piRNAs以不完全互补的方式，反式沉默物的表达。这种靶向性沉默，是不依赖于Piwi核酸内切酶活性或剪切的。相反，piRNAs引发了一种局限性二级内源小干扰RNA（endo-siRNA）反应。内源蛋白编码基因和转座子物在与piRNAs互补的位点发生Piwi依赖的endo-siRNA反应。而Piwi的突变则可解除这种。piRNAs生物合成的基因组位点缺乏蛋白编码基因，且常与转座子的起始和末端序列分别以有义或反义方式重叠。该研究结果提示，线虫类piRNA基因簇是为抵抗移动性DNA元件而进化出来的。由此，piRNA在线虫体内提供了可遗传的，序列性RNAi的驱动因子。10.Nature：林海帆小组－piRNAs在基因调控中发挥重要作用doi:10.1038/nature06263来自杜克大学医学院细胞生物学系，耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心及细胞生物学系的研究人员发现了不同于已知的表观遗传沉默中的Piwi和RNA介导的沉默途径的功能——他们识别出了果蝇中12,903个piRNAs（Piwi-interacting RNAs ），并描述了其特征，首次提出piRNAs在基因功能调控方面扮演着重要角色。这一研究公布在《自然》上。在这篇文章中，研究人员识别出了果蝇中12,903个Piwi作用RNAs（Piwi-interacting RNAs，piRNAs），并描述了其特征，认为rasiRNAs属于piRNAs的一个亚集。同时研究人员也发现Piwi能促进染色体3的右臂上次尾端（subtelomeric）异染色质（也称为端粒相关序列，TAS，即全称为3R-TAS）上常染色质组蛋白修饰，以及piRNA的。进一步研究发现piwi突变型中3R-TAS失去了常染色体组蛋白修饰，而且3R-TAS1 piRNA和3R-TAS上一种whiter受体基因的表达也受到了。而P element插入到3R-TAS1piRNA编码序列下游的128碱基对则可以逆转3R-TAS的常染色体组蛋白修饰，以及piwi突变型中3R-TAS1piRNA的表达。这些研究说明Piwi促进了3R-TAS异染色质中常染色质特性，以及其活性，这不同于已知的表观遗传沉默中的Piwi和RNA介导的沉默途径的功能，研究人员也指出这些活性功能也许是通过3R-TAS1piRNA相互作用获得，而且对于生殖干细胞（germline stem-cell）的维持是必要的。

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