应用微尺度热泳（MST）探究PD-1PD-L1结合亲和力

　　导读：蛋白质相互作用表征是生命科学等许多领域，尤其是药物研发领域的关键因素。微尺度热泳（MST）是一种新的方法，可以定量分析蛋白-蛋白相互作用（PPI），样品消耗量少。另外，这项技术的主要优点之一是无需繁琐的纯化步骤即可获得所需蛋白。本文主要介绍应用MST来确定PD-1/PD-L1结合亲和力的协议。

　　众所周知，免疫系统能够影响肿瘤控制。免疫系统尝试中和恶性细胞时，某些细胞在免疫系统消除和自身增殖之间保持平衡状态。事实上，肿瘤细胞已经形成免疫逃逸机制，通过过表达免疫调节，如PD-L1和B7-1，与宿主保持平衡。

　　肿瘤微具有高度免疫性，能够局部调节肿瘤浸润性T淋巴细胞的抗肿瘤反应。通常地，肿瘤浸润性T淋巴细胞表达PD-1，肿瘤细胞表达PD-1配体，PD-L1或PD-L1。应用PD-1抗体阻断PD-1与其配体之间的相互作用，能够恢复口咽癌中的这种免疫功能。因此，某些患者可能受益于阻断PD-1与其配体相互作用的靶向治疗方法。

　　PD-1是由288个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，与CD28和CTLA-4一样，属于免疫球蛋白超家族。PD-1由胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成。胞质结构域具有两种酪氨酸，一种存在于免疫受体酪氨酸基序（ITIM）中，另一种存在于免疫受体酪氨酸开关基序（ITSM）中，它们是对蛋白质的作用的必要因素。PD-1表达于CD4+细胞、CD8+细胞、NK细胞、B细胞、外周T细胞、树突细胞和单核细胞表面。低水平PD-1足以提供T细胞活化的作用。缺陷的PD-1与PD-L1结合不会T细胞活化。这说明PD-L1的功能与其和PD-1的相互作用紧密相关。、

　　PD-1蛋白与两种配体，即程序性死亡配体1（PD-L1，B7-H1，CD274）和程序性死亡配体2（PD-L2，B7-DC，CD273）相互作用。PD-L1是具有290个氨基酸的I型跨膜蛋白，由CD274基因编码，该蛋白由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成。PD-L1表达于B和T淋巴细胞、巨噬细胞、间充质细胞和树突细胞表面。与该家族的其它不同，PD-L1也存在于非造血细胞，如内皮、心脏、肺、胰腺、肌肉和胎盘细胞表面。PD-L1和B7-1通过它们的IgV样结构域相互作用。

　　目前正在研发靶向阻断PD-1/PD-L1轴的各种治疗方法。Nivolumab是一种靶向PD-1 / PD-L1通的抗体，最近，因其在临床试验中表现出显着的抗肿瘤反应，获FDA批准用于黑素瘤治疗。研究人员已经研究了低量剂调节PD-1/PD-L1信号通的能力。Bristol-Myers Squibb最近表示，新型PD-L1剂（（2-甲基-3-联苯基）甲醇衍生物）可以与PD-L1结合，并以化学计量浓度解离PD-1 / PD-L1复合物。

　　多年来，研究人员通过表面等离子共振（SPR）和等温滴定量热法探究了PD-1与PD-L1结合作用，但是这些研究引发了关于解离（Kd）值的争议。MST是以低样品消耗量，定量分析蛋白-蛋白相互作用（PPI）的新方法。该技术基于沿着微观温度梯度运动的，检测其水化膜、电荷或尺寸的变化。应用荧光标记一种结合伴侣，另一种结合伴侣不标记。

　　研究人员应用MST来确定PD-1/PD-L1结合亲和力，而无需从细胞裂解物中纯化靶蛋白的协议，将MST方法应用于在CHO-K1细胞中表达的PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP，并首次确定了肿瘤免疫逃逸中，PD-1与其配体PD-L1形成的复合物的亲和力。

　　为确定用于分析蛋白质及其配体之间相互作用的最佳方法，研究人员研究了几种溶解缓冲液和几种用于分析热泳期间温度记录的缓冲液。细胞裂解液可以调节标记蛋白的荧光。如PD-1-eGFP蛋白裂解所示，与使用去污剂缓冲液相比，使用不含去污剂的缓冲液导致荧光降低。研究人员还加入蛋白酶剂混合物以防止目标蛋白质降解。RIPA(放射免疫沉淀)裂解缓冲液（1800 FI单位）提取后产生最高结果。理想的缓冲液必须在16个毛细管中产生均匀的荧光，最大允许偏差为10％。温度记录仪不应呈现聚合曲线特征，这对解析测量形成了障碍。

　　表达各自融合蛋白PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP的细胞都在RIPA缓冲液中裂解。稀释提取后的裂解物，获得400-1600FI单位的最佳荧光水平。荧光蛋白浓度保持恒定值35nM。应用CHO-K1细胞评估未稀释裂解物中检测不到的荧光背景信号。首次测量在22℃标准毛细管HEPES缓冲液中进行，MST功率为60％，LED功率为40％。在整个范围内荧光变化很大。温度记录图呈现聚合特征曲线。拟合的结合曲线偏离了非理想操作条件，需要进行优化。另一方面，GFP对照蛋白与PD-L1没有产生结合曲线。因此，应用不同的缓冲液进行新实验可以减少背景信号以及不同毛细血管的整体荧光变化。

　　此外，研究人员还进行了另外两项实验来确定用于研究蛋白-蛋白相互作用的最佳温度。SPR设定的大部分最大Kd值为37℃，大多数应用热泳研究相互作用的实验温度为22℃~25℃。PBS-T缓冲液37℃时的结合曲线在毛细血管内引起对流现象，使得不可能确定Kd。因此，最好避免可能亲和力测定的任何现象，这即是应用较低温度探究蛋白-蛋白相互作用，确定最大亲和力对应的解离的原因。

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