CAR-T细胞制备的人工智能时代到来了吗？

　　随着2017年7月及11月的Kite和诺华CART产品相继被FDA 获批上市，在12月26日我国CFDA也发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》。CAR-T无疑是2017年医学界最火的一个名词。

　　CAR-T细胞能靶向识别恶性肿瘤细胞抗原，将能够识别该抗原的结构通过基因工程技术的手段使其在患者T细胞的表面，进而性的识别恶性肿瘤细胞，最终将其杀灭。CAR是人为设计的结构，主要包括胞外抗原结合区，跨膜区，胞内信号区。胞外抗原结合区主要是来源于与肿瘤性抗原相对应的单克隆抗体的单链可变区（scFv），通过跨膜区与胞内的信号区相连。胞内信号区最初包括TCR复合体的CD3ζ链，具有免疫受体酪氨酸活化基序负责T细胞信号的转导。从最初的单一信号发展到加入共刺激（CD28，4-1BB），再到将细胞因子的基因也一同导入，逐渐增强CAR-T的识别能力，使这项技术更为精准、安全。

　　CAR-T细胞制备过程相当复杂， 技术含量很高，按照现行行业标准，需要大批高科技的从业人员以及GMP级别的细胞加工制备场地。场地和人力资源是导致诺华相关产品售卖47万美元天价的主要原因。

　　CFDA在《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》的第三备工艺与过程中明确提出：细胞治疗产品生产过程中使用的筛查试剂盒、分选试剂或材料、细胞分离或活化用抗体或磁珠、培养基、培养过程的添加物和与产品或中间样品接触的生产设备或材料等应经过严格的筛选和适用性的评估，应关注感染性病原微生物和免疫原性等安全性风险，尽量使用经监管批准的产品，否则使用适合产品的高质量级别的产品。尽量采用连续的制备工艺，如果生产过程中有不连续生产的情况时，应对细胞的保存条件和时长进行研究与验证。尽量采用封闭的或半封闭的制备工艺，以减少污染和交叉污染的风险。

　　在大部分B细胞表面均有表达CD19和CD20，但现有的临床数据已经发现在CAR-T治疗过程中出现脱靶现象。为了尽量清除肿瘤细胞，降低复发风险，国内已有实验室开始开发双靶点CAR-T细胞相关产品。

　　为了对比产品的性能，在生产的过程中，研究人员设置了1例制备的CD19 CAR-T细胞与另外的4例制备CD20/C19双CAR细胞作为对比。

　　结合以上两个表格，可以看到，终产物CAR-T细胞达到2.5~4.1×109； 假设60kg体重患者，输注细胞数量可以达4×107/kg以上，足够临床使用。

　　该研究还做了两个CAR-T细胞功能性检测的实验。一为经典肿瘤细胞体外杀伤实验，二是IFN-γ检测实验。和预期的一致，当CAR-T 细胞与表达CD19或CD20，或同时表达两者的肿瘤细胞相接触后，出了大量的IFN-γ。下左图为报道的IFN-γ Elispot 实验结果，右图为以流式方法检测结果。互相验证了所制备出的CAR-T细胞已获取了这一重要功能。

　　在杀伤上也有不凡表现。但有趣的是，所制备出的终产物细胞也非性的识别了CD19及CD20 阴性的K562。 该小组疑是NKT细胞所为，于是在去除了CD56阳性细胞后重复了杀伤实验，结果正如预期，CART细胞不但有了识别的肿瘤细胞的能力，且在以50：1的CAR-T细胞对肿瘤细胞的实验设计中，达到了高达近80%的肿瘤裂解。即使在只有6：1的CART细胞对肿瘤细胞的实验中仍保留了20% 的性肿瘤识别及裂解。

　　由于CliniMACS Prodigy设计的初衷是在于密闭性和自动化生产系统，因而在细胞扩增倍数上有所，暂时不适用于需要大量CAR-T细胞的治疗方案。但已经足够目前报道的所有自体CAR-T细胞治疗用量。

　　目前热门的CAR-T生产受制于标准化生产流程的制定以及ISO-5标准的洁净房间作为细胞生产工厂。临床治疗级别的CAR-T细胞需要在GMP实验室进行制备。这些都是在目前或者将来了CAR-T细胞制备的硬性条件。但CliniMACS Prodigy密闭系统和自动化生产程序完美的解决了这个需求。F Zhu 在其文章中提到：常规GMP实验室制备CAR-T细胞的过程起码需要3位以上熟练的科研人员来操作多个的步骤，Prodigy的细胞处理过程基本可以实现“walk away”。在CliniMACS Prodigy上制备CAR-T细胞，仅需要经过2天左右的培训即可上岗操作。可以在相对简单的场所，简单的人员培训就能实现CAR-T细胞生产制备，这种去集中化的生产模式，将来应该可以更及时地惠及更多的患者。

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